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科研新知
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Science | 检测CRISPR脱靶效应的新方法

自2012年问世以来,CRISPR基因组编辑技术在治疗许多顽固性疾病方面显示出了巨大的潜力。然而,由于治疗相关细胞类型的潜在脱靶效应尚难以确定,此治疗方法一直未能应用到临床。


如今,格莱斯顿研究所(Gladstone Institutes)和创新基因组研究所(IGI)的一组科学家与阿斯利康公司(AstraZeneca)的合作伙伴开发出了一种可靠的方法来实现这一点。相关研究结果发表在2019年4月19日的Science期刊上,论文标题为“Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq”。


CRISPR通过在特定位置切割DNA来编辑一个人的基因组,目前的挑战是确保该工具不会在DNA的其它地方进行剪切从而造成损伤,即所谓的“脱靶效应”,这可能会产生无法预料的后果。


“当CRISPR切割时,DNA就被破坏了,”Wienert博士说, “因此,为了生存,细胞在基因组的特定位置招募许多不同的DNA修复因子来修复断裂,并将断裂的两端重新连接起来。我们认为,如果我们能找到这些DNA修复因子的位置,我们就能确定被CRISPR切割的位置。” 为了验证这一想法,研究人员研究了一组不同的DNA修复因子。他们发现其中一个被称为MRE11的DNA修复因子是DNA切割位点的第一批响应者之一。利用MRE11,他们开发了一项名为DISCOVER-seq的新技术,可以识别出CRISPR在基因组中切割的确切位置。



MRE11芯片在分子水平上表征了cass诱导的DSBs (图片摘自DOI: 10.1126/science.aav9023)


“人类基因组非常大——如果你打印出整个DNA序列,你最终会得到一本16层楼高的小说,”医学博士、格莱斯顿大学高级研究员、IGI副主任Conklin解释说,“当我们想用CRISPR来切割DNA时,就好像我们在试图删除小说中某一页上的某个特定单词。”


Conklin补充说:“你可以把DNA修复因子看作是书中添加的不同类型的书签。”“虽然有些人可能会将整个章节添加到书签中,但MRE11是一种书签,它可以精确到已修改的字母。”


目前虽然存在多种检测CRISPR脱靶效应的方法,却都有它们的局限性,从产生假阳性结果到杀死正在检测的细胞。并且,目前最常用的方法仅限于实验室培养的细胞,不包括用于病人来源的干细胞或动物组织。


“因为我们的方法依赖于细胞的自然修复过程来识别伤口,它被证明是侵入性更小,更可靠,”Corn博士说,他现在在苏黎世联邦理工学院经营着一个实验室。他们能够在诱导多能干细胞、患者细胞和小鼠身上测试我们的DISCOVER——seq方法。发现表明:这种方法可能在任何系统中使用,而不仅仅是在实验室中。



使用DISCOVER-seq进行无偏差的非目标发现 (图片摘自DOI: 10.1126/science.aav9023)


“通过将DISCOVER-seq方法应用于新的细胞类型和系统,还揭示了CRISPR用于编辑基因组的机制的新见解,这将有助于更好地理解该工具如何工作的生物学原理。”



DISCOVER-seq在病人来源的间充质干细胞和体内 (图片摘自DOI: 10.1126/science.aav9023)


Conklin 还说,“新方法大大简化了识别脱靶标效应的过程,同时也提高了结果的准确性,这可以让我们更好地预测基因组编辑在临床环境中是如何工作的。因此,这是改善临床前研究和使基于CRISPR的治疗更接近需要的患者的一个重要步骤。”



参考文献:


1. New Method to Detect Off-Target Effects of CRISPR. https://gladstone.org/about-us/press-releases/new-method-detect-off-target-effects-crispr

2. Beeke Wienert et al. Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq. Science, 2019, doi:10.1126/science.aav9023.


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